Desnaturalización del DNA: ¿en qué consiste la desnaturalización del DNA? ¿Cómo se conseguiría desnaturalizar DNA en el laboratorio? ¿Cómo puede reconstruir el dúplex desnaturalizado? ¿En algún proceso biológico celular de síntesis es necesaria la desnaturalización reversible del DNA de manera temporal? Razone sus respuestas. [1,25 puntos]
EN QUÉ CONSISTE. La desnaturalización del ADN es la SEPARACIÓN de las dos hebras de la doble hélice, que quedan como cadenas sencillas independientes. Lo que se rompe son los PUENTES DE HIDRÓGENO que emparejan las bases complementarias —dos entre adenina y timina, tres entre guanina y citosina— y las interacciones de apilamiento entre bases contiguas, todos ellos enlaces DÉBILES. No se rompe ningún enlace covalente: los enlaces fosfodiéster que forman el esqueleto de cada hebra permanecen intactos, y por eso la secuencia de cada cadena se conserva íntegra. Es, por tanto, un cambio de estructura secundaria y no una degradación.
El proceso se sigue midiendo la absorbancia a 260 nanómetros, porque el ADN de cadena sencilla absorbe más que el bicatenario: es el llamado efecto hipercrómico. La temperatura a la que se ha desnaturalizado la mitad de la muestra se denomina TEMPERATURA DE FUSIÓN, y depende de la composición de bases: cuanto mayor es la proporción de guanina y citosina, que se emparejan con tres puentes de hidrógeno en lugar de dos, más alta es. Medirla permite, de hecho, estimar la riqueza en GC de un ADN.
CÓMO DESNATURALIZARLO EN EL LABORATORIO. Por cualquier procedimiento que debilite los enlaces débiles sin atacar los covalentes:
CALOR, que es el método habitual. Elevando la temperatura por encima de la de fusión, entre 90 y 100 grados en la mayoría de los ADN, la agitación térmica vence los puentes de hidrógeno y las hebras se separan.
pH EXTREMO, ácido o alcalino. Al cambiar el estado de ionización de las bases nitrogenadas, estas dejan de poder formar los puentes de hidrógeno que las emparejan; el hidróxido sódico se usa con frecuencia con este fin.
AGENTES QUÍMICOS DESNATURALIZANTES, como la urea o la formamida, que compiten formando puentes de hidrógeno con las bases, o disolventes orgánicos.
BAJA FUERZA IÓNICA. Los cationes del medio apantallan las cargas negativas de los grupos fosfato; si se retiran, la repulsión electrostática entre las dos hebras las separa.
CÓMO SE RECONSTRUYE EL DÚPLEX. Por RENATURALIZACIÓN o hibridación: basta con revertir lentamente la condición que provocó la separación, es decir, ENFRIAR DESPACIO por debajo de la temperatura de fusión, o devolver el pH a la neutralidad, o restablecer la concentración salina. Las dos hebras se reconocen entre sí por complementariedad de bases y vuelven a emparejarse.
Hay una condición importante: el enfriamiento debe ser LENTO. Si se enfría bruscamente las hebras no tienen tiempo de encontrar a su complementaria y quedan como cadenas sencillas plegadas al azar. Y en eso se apoyan varias técnicas: si en la mezcla se pone ADN de dos especies distintas, al renaturalizar se forman híbridos entre las regiones que son complementarias, y cuanto más parecidas son las secuencias más estable resulta el híbrido; sobre este principio se basan la hibridación de ácidos nucleicos, las sondas de ADN y los estudios de parentesco evolutivo.
PROCESOS BIOLÓGICOS QUE LA NECESITAN. Sí, y son precisamente los dos procesos de síntesis en los que el ADN actúa de molde, porque la información está en las bases y estas quedan hacia el interior de la hélice, inaccesibles mientras las dos hebras estén emparejadas:
La REPLICACIÓN del ADN. La HELICASA separa localmente las dos hebras rompiendo sus puentes de hidrógeno y abre la horquilla de replicación; las proteínas SSB mantienen las hebras separadas mientras la polimerasa copia cada una de ellas. La topoisomerasa libera la tensión que la apertura genera por delante. Detrás de la horquilla, las hebras nuevas se aparean con sus moldes y la doble hélice se reconstituye.
La TRANSCRIPCIÓN. La ARN POLIMERASA abre una burbuja de una decena de pares de bases, copia la hebra molde y, a medida que avanza, la doble hélice se vuelve a cerrar por detrás. El ARN sintetizado se desprende y no queda apareado.
En los dos casos la desnaturalización es LOCAL, TEMPORAL y REVERSIBLE: afecta solo al tramo que se está copiando, dura lo que tarda la enzima en pasar y la hélice se restablece de inmediato. Se consigue además sin calor y sin cambios de pH, mediante enzimas que gastan ATP para hacer el trabajo que en el laboratorio hace la temperatura. Fuera de la síntesis, también la recombinación durante la meiosis y la reparación del ADN exigen abrir la doble hélice.
Y hay una aplicación biotecnológica que reproduce exactamente el fenómeno: la PCR, cuya primera etapa de cada ciclo es una desnaturalización térmica a 94 grados, seguida de una renaturalización controlada al bajar la temperatura para que los cebadores hibriden. De hecho, la técnica solo es posible porque la desnaturalización del ADN es reversible.