Las enzimas de restricción, o endonucleasas de restricción, son enzimas de origen bacteriano que reconocen una secuencia corta y específica de nucleótidos en el ADN de doble cadena y cortan las dos hebras en ese punto o cerca de él. Las secuencias que reconocen suelen tener entre cuatro y ocho pares de bases y ser palindrómicas, es decir, leerse igual en las dos hebras en sentido cinco prima a tres prima. La EcoRI de Escherichia coli, por ejemplo, reconoce GAATTC y corta entre la G y la A, dejando extremos escalonados con cuatro bases desemparejadas, los llamados extremos cohesivos.
Su función natural es defensiva: forman parte del sistema de restricción y modificación con el que la bacteria degrada el ADN de los virus que la infectan, mientras su propio ADN queda protegido porque una metilasa le añade grupos metilo en esas mismas secuencias y la enzima ya no lo reconoce.
En el laboratorio son la herramienta fundamental de la ingeniería genética. Permiten cortar cualquier ADN siempre en los mismos sitios, y como todos los fragmentos generados por una misma enzima tienen extremos cohesivos complementarios, un fragmento de un organismo se puede empalmar con un vector de otro y sellar la unión con la ADN ligasa. Ese es el paso que hace posible el ADN recombinante.
La PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica que amplifica in vitro un fragmento concreto de ADN, obteniendo millones de copias a partir de una cantidad mínima de muestra. En el tubo se ponen el ADN molde, los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, dos cebadores cortos de ADN complementarios de los extremos del fragmento que se quiere copiar, iones magnesio y una ADN polimerasa termoestable, habitualmente la Taq polimerasa, obtenida de una bacteria termófila para que resista los calentamientos.
Cada ciclo consta de tres etapas, que se distinguen por la temperatura:
Desnaturalización, a unos 94 o 95 grados. El calor rompe los puentes de hidrógeno entre las bases y las dos hebras del ADN se separan, quedando cada una disponible como molde.
Hibridación o annealing de los cebadores, entre 50 y 65 grados según su secuencia. Al bajar la temperatura, cada cebador se une por complementariedad al extremo tres prima de su hebra molde, delimitando así los dos bordes del fragmento que se va a copiar. Son los cebadores los que dan a la técnica su especificidad.
Extensión o elongación, a unos 72 grados, que es la temperatura óptima de la Taq polimerasa. La enzima alarga cada cebador añadiendo nucleótidos complementarios del molde en sentido cinco prima a tres prima, y sintetiza la hebra nueva.
Al terminar el ciclo se ha duplicado el número de moléculas del fragmento, y como las copias sirven de molde en el ciclo siguiente, el crecimiento es exponencial: tras
ciclos hay
copias, de modo que treinta ciclos, que llevan unas dos horas en un termociclador, dan del orden de mil millones de copias.
Una aplicación de las enzimas de restricción es la construcción de organismos transgénicos y de proteínas recombinantes: con ellas se abre un plásmido y se recorta el gen humano de la insulina, los dos extremos cohesivos se empalman con la ligasa y el plásmido recombinante se introduce en una bacteria, que pasa a producir insulina humana. Otra es la obtención de huellas genéticas por análisis de fragmentos de restricción.
Una aplicación de la PCR es el diagnóstico de enfermedades infecciosas: amplificando un fragmento característico del genoma del patógeno se detecta su presencia aunque haya muy pocas copias en la muestra, que es lo que se hace en las pruebas de covid. También se usa en identificación genética y medicina forense, en pruebas de paternidad y en la detección de mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias.