Ejercicio resuelto de Biología · 2024

Responda las siguientes preguntas relacionadas con la PCR: [2 puntos]

a) ¿Qué es la fase de desnaturalización en la PCR y a qué temperatura se realiza típicamente? [0,5 puntos]

b) ¿En qué consiste la fase de hibridación (alineamiento o annealing) y por qué es importante la temperatura en esta fase? [0,5 puntos]

c) ¿Qué es la ADN polimerasa (Taq polimerasa)? Cite su función y alguna de sus características que la hacen importante en la PCR. [0,5 puntos]

d) ¿Qué es el marcador de peso molecular? [0,5 puntos]

$\textbf{a) ¿Qué es la fase de desnaturalización en la PCR y a qué temperatura se realiza típicamente? [0,5 puntos]}$

La desnaturalización es el primer paso de cada ciclo de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). En ella la doble hélice del ADN se separa en dos hebras individuales, porque el calor rompe los puentes de hidrógeno que unen las bases nitrogenadas complementarias; los enlaces fosfodiéster de cada hebra no se ven afectados, de modo que las cadenas quedan intactas pero separadas.

Se realiza a temperatura alta, típicamente entre $90$ y $100\,^{\circ}\text{C}$, y su finalidad es dejar accesibles las hebras molde para que los cebadores puedan unirse a ellas en el paso siguiente.

$\textbf{b) ¿En qué consiste la fase de hibridación (alineamiento o annealing) y por qué es importante la temperatura en esta fase? [0,5 puntos]}$

En la hibridación los cebadores o primers —secuencias cortas de nucleótidos, complementarias de los extremos de la región que se quiere amplificar— se unen por complementariedad de bases a las hebras molde separadas en el paso anterior. Son ellos los que delimitan el fragmento que se va a copiar y los que proporcionan a la polimerasa el extremo $3'$ libre desde el que empezar a sintetizar.

La temperatura se baja hasta un intervalo de unos $50$ a $65\,^{\circ}\text{C}$ y es un parámetro crítico. Si fuera demasiado alta, los cebadores no llegarían a unirse y no habría amplificación; si fuera demasiado baja, se unirían a secuencias con las que solo son parcialmente complementarias y se amplificarían fragmentos inespecíficos. La temperatura adecuada es, pues, la que garantiza que la unión sea específica.

$\textbf{c) ¿Qué es la ADN polimerasa (Taq polimerasa)? Cite su función y alguna de sus características que la hacen importante en la PCR. [0,5 puntos]}$

La Taq polimerasa es la ADN polimerasa que se emplea en la PCR, aislada de la bacteria termófila *Thermus aquaticus*, que vive en aguas termales.

Su función es sintetizar las nuevas hebras de ADN: alarga los cebadores añadiendo nucleótidos complementarios a los de la hebra molde en sentido $5' \rightarrow 3'$, con lo que duplica en cada ciclo la región de interés.

La característica que la hace imprescindible es su termoestabilidad: soporta las temperaturas próximas a $95\,^{\circ}\text{C}$ de la fase de desnaturalización sin desnaturalizarse ella misma. Gracias a ello no hay que añadir enzima nueva en cada ciclo y el proceso puede automatizarse por completo en un termociclador.

$\textbf{d) ¿Qué es el marcador de peso molecular? [0,5 puntos]}$

El marcador de peso molecular, también llamado patrón o estándar de tamaño, es una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños conocidos que se carga en un carril del gel junto a las muestras cuando se analiza el producto de la PCR por electroforesis.

Como en la electroforesis los fragmentos migran tanto más deprisa cuanto más pequeños son, el marcador genera un patrón de bandas de referencia con el que se comparan las bandas de la muestra. Así se estima el tamaño de los fragmentos amplificados, lo que permite comprobar si la amplificación ha sido específica y si el producto obtenido es el esperado.